一、稀释液的制作

磷酸盐缓冲稀释液

贮存液：

磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g；

蒸馏水 500mL；

用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2（图1-1、1-2），用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。

稀释液：

用蒸馏水稀释1.25mL贮存液至1000mL，分装于合适容器，121℃高压灭菌15min。

二、培养基制作

① 计算出所需数量，用电子称、称量纸、药勺来称取。

② 放入比所用蒸馏水大的烧瓶中，使之充分混匀于蒸馏水后加热溶解并煮沸。

※ 备注：即使是同一培养基，各个厂家的配制方法多少有些不同，所以一定要充分参照培养基上的说明。

2.1 倾注培养培养基：

●平板计数琼脂等：高压灭菌后保存，使用时加温溶解。

●去氧胆酸盐琼脂培养基：使用时将培养基粉末加温溶解。

※备注：倾注培养时，向培养基分注的步骤参照下述的注意事项：

①样液稀释以及从接种到培养基混合完毕，最好在15分钟以内完成。

②每个平皿的分注量约15-20ml。分注后将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要让培养基从平皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。

③分注时三角烧瓶挂有培养基滴时，下一次分注的培养基可能被烧瓶外壁的细菌污染，所以要用酒精棉擦拭，再将瓶口用火焰灭菌。

2.2 平板培养基：

平板培养基是将溶解后的培养基分注15-20ml到无菌平皿里，使之凝固。

●  TCBS琼脂培养基、DHL琼脂培养基：加温溶解后，分注、凝固、干燥表面。为了防止沉淀的发生，加温溶解后要充分混匀（注意不要起泡）。

●  EMB琼脂培养基：高压灭菌后，分注、凝固、干燥表面。

● 卵黄甘露醇高盐琼脂培养基：将鸡蛋放在95%酒精中浸泡1小时左右，用酒精棉（纱布）擦拭蛋壳表面，打开鸡蛋取出卵黄。加入经高压灭菌后冷却到55-60℃培养基里（6%卵黄）搅拌摇匀凝固后干燥表面（搅拌时不要起泡）。若培养基温度过高，卵黄凝固，过低则培养基分注时开始结块，所以操作要迅速。

※ 备注：分注后将平皿盖打开置于无菌工作台/恒温培养箱内使培养基表面干燥。

干燥时间基准如下：

无菌超净台：15分钟；

37℃恒温箱内倒置：20-30分钟。

2.3 斜面/高层斜面培养基：

 

加温溶解后的培养基分注到小试管3-4ml，中试管8-10ml。高压灭菌后将试管冷却至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在合适高度的器具上，搁置斜面长度以不超过试管总长一半为宜。高层斜面培养基制成斜面高1/3，高层为2/3。

●  营养琼脂培养基：加温溶解后分注到中试管，高压灭菌后制成斜面。

●  TSI琼脂培养基：加温溶解后分注到小试管，高压灭菌后制成高层斜面。

2.4 液体培养基

   

加温溶解后的培养基和高层/斜面培养基一样，分注。一般液体培养基因过度加热易引起培养基变质，所以加热（加温溶解、高压灭菌）后用流动水等急速冷却。

●  EC、BGLB培养基：加温溶解后分注到放有倒立的发酵管的试管后高压灭菌，灭菌后用流动水急速冷却。

●  EEM培养基：加温溶解后于三角瓶在100℃灭菌30分钟。

※ 备注：

每批培养基制备后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、瓶塞被培养基污染等，均应挑出弃去。培养基应存放于冷暗处，最好放于冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平皿培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有明显的标识。

三、 基本操作：

3.1 灭菌方法：

① 酒精杀菌：用75%的酒精及酒精棉，用于手指、实验台、工器具、样品外包装等的杀菌。

② 火焰灭菌：检查中常用酒精灯/煤气灯，将烧瓶、试管、吸管、剪刀、镊子瓶口部或前端，还有接种针、接种环接种前后通过火焰。

③ 高压灭菌：主要是吸管、培养基、稀释水以及检查完毕后的培养基等无菌。

④ 煮沸灭菌：在沸水中加热15-30min的方法。用于镊子、剪刀、吸球等的工具灭菌。

3.2  分离转种培养

3.2.1 平皿划线：

3.2.1.1分段划线：用于含菌量较多的样品。

右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。（图3-1、3-2）

用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝，将灭过菌并冷却的接种环挑取菌（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫）先在平板培养基的一边轻轻研磨作第一次平行划线，再转动平皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线或通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。（图3-3、3-4）

3.2.1.2连续划线：含菌量不多的样品。

先将接种环用火焰灭菌，待冷却后挑取菌，涂于平板的上端，随即向下连续平行划线。（图3-5）

※备注：

（1）划线时接种环与平板表面所成的角度为45度角，以免划破琼脂。划线要尽量直、密、匀而不重复。（图3-6）

（2）将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在火焰内焰中烧灼，使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，使菌体爆溅，造成污染。（图3-7）          

3.2.2 涂布方法：

将菌悬液小心滴在平板培养基表面中央位置（图3-8），右手拿无菌涂布棒平放在平板培养基表面，将菌悬液先沿一条直线轻轻来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一条垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布棒再涂布几次，使菌液均匀吸收  （图3-9、3-11）。（或将无菌涂布棒平放在平板培养基表面，将菌悬液沿同心圆方向轻轻地向外扩展）使之分布均匀（图3-10）。室温下静置5～l0min，使菌液渗透于培养基。

3.2.3液体接种法

3.2.3.1 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。

3.2.3.2由液体培养物接种液体培养基时：可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。（图3-12、3-13）

※ 备注：

接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球、消毒液等擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内或高压灭菌。

3.2.4 斜面接种法

将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～50度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。试管塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌试管。

将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上试管塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧试管塞。将接种管做好标记后再放入试管架，即可进行培养。（图3-14）

3.2.5 穿刺接种法

接种高层或半高层斜面培养管时，用接种针挑取菌落，向培养基中心穿刺，一直插到接近管底0.4cm处，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。（图3-15、3-16）